近期，宝藤生物与福建省泉州市第一医院肿瘤外科合作，通过血浆外泌体中Small RNA高通量测序及生物信息分析用于甲状腺结节良恶性的辅助鉴别诊断，相关研究成果Exosomal miRNAs are potential diagnostic biomarkers between malignant and benign thyroid nodules based on next-generation sequencing发表于著名肿瘤学研究杂志《Carcinogenesis》。

研究背景

临床中，约10%-30%的甲状腺结节在通过细针穿刺（FNA）细胞学检查后给出的结果是无法明确判断良恶性。其中大约20%-25%的患者术后病理诊断为甲状腺癌，而另外75%-80%的甲状腺结节患者则接受了非必须的手术治疗。所以，寻找精确的分子标志物用于FNA结果不明确的甲状腺结节辅助诊断在临床上至关重要。

针对这一临床问题国际与国内已经开展了多项研究，而绝大多数仅是针对甲状腺肿瘤组织进行的分子标志物研究。然而临床实践中，FNA可获取的样本极其少量，在经过细胞学分析后，很难获得足够量的剩余样本用于后续分析；而且，由于肿瘤组织存在异质性，极少量的样本检测结果难以覆盖肿瘤全貌。液态活检技术的发展在很大程度上突破了以上两点局限性，其主要技术包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体等。肿瘤来源的外泌体包含RNA、DNA、蛋白质等组分，可以在细胞间传递，其中miRNA是一类长度约为19-25nt的非编码RNA，其功能是在基因转录后进一步调节基因表达水平。外泌体miRNA由于其结构稳定、通量较高等优势，在肿瘤的筛查领域受到了研究者极大的青睐。

本研究通过高通量测序技术及生物信息分析，绘制了乳头状甲状腺癌和结节性甲状腺肿患者血浆外泌体中的miRNA表达差异图谱，鉴定并筛选获得了多个具有甲状腺结节良恶性鉴别诊断潜力的血浆外泌体miRNAs。

研究方法

项目入组了于泉州市第一医院肿瘤外科就诊的甲状腺肿瘤患者，在接受治疗和侵入性检查前，采集外周血样本并分离血浆。以患者的术后病理结果为依据，将入组的患者分为：乳头状腺癌患者（PTC，13例）组和结节性甲状腺肿患者（NG，7例）组。

血浆外泌体的分离采用超速离心法，对分离获得的外泌体抽提总RNA，采用Small RNA建库测序的方法进行上机测序，并对下机的原始数据进行生物信息学分析。

主要结果

血浆外泌体miRNA差异表达图谱（PTC vs NG）

在全部20例样本中共检测到1629个miRNAs的表达，以NG组为对照，在PTC组中鉴定并获得了129个差异表达miRNAs，其中49个miRNAs表达上调、80个miRNAs表达下调。差异基因表达热图中的聚类分析，可以将PTC组和NG组样本较好的进行分离。其中10个miRNAs仅在PTC患者血浆外泌体中检测到，而有15个miRNAs仅在NG患者血浆外泌体中被检测到。

图1（A）差异表达miRNAs火山图；（B）差异表达水平分别排前5位的上下调miRNAs；（C）PTC和NG组的差异表达聚类热图

进一步分析发现共有103个miRNAs鉴别到了靶基因，其中miRNA的靶基因数目中位数为18。为了更好地理解差异表达miRNAs的功能，本研究对所有的靶基因进行了KEGG富集分析，所有靶基因被富集到了27条信号通路上；其中7条信号通路是已经明确报道的癌症相关信号通路（图2）。

图2 差异表达miRNAs靶基因的信号通路富集分析结果

差异表达miRNAs用于PTC和NG患者的鉴别诊断

我们在两组患者中，对每一个差异表达miRNA水平绘制ROC曲线，获得AUC值。图3A展示了所有miRNAs的AUC分布范围（0.571-0.951）。其中有11个miRNAs的AUC值在0.9以上，miR-5189-3p获得最优的AUC值0.951，miR-5189-3p在PTC患者血浆外泌体中上调。

图3 （A）差异表达miRNAs用于PTC和NG鉴别诊断的AUC分布图；（B）miR-5189-3p的ROC曲线图

结论

本研究首次绘制了乳头状甲状腺癌和结节性甲状腺肿患者血浆外泌体中miRNAs差异表达谱，并发现多个具有鉴别诊断潜力的血浆外泌体miRNAs。在未来的研究工作中，我们将在更大的临床样本队列中对候选的miRNAs进行验证，同时我们将进一步研究各miRNA调控甲状腺癌发生发展的分子机制。

参考文献：Exosomal miRNAs are potential diagnostic biomarkers between malignant and benign thyroid nodules based on next-generation sequencing. Carcinogenesis. 2019 Sep 27. pii: bgz160. doi: 10.1093/carcin/bgz160.