近期，宝藤生物与泉州市第一医院合作，结合全外显子组测序和转录组测序，发现HPV-和HPV+宫颈癌患者的肿瘤组织呈现出全然不同的基因组和转录组改变。研究成果“Whole-exome and RNA sequencing reveals novel insights into the pathogenesis of HPV associated cervical cancer”于2019年7月发表在《Cancer Biomarkers》上。

研究背景

宫颈癌是第一个被确定有单一明确病因的癌症，大多数的宫颈癌患者都有HPV感染。其中HPV16、18、52、58等是常见的HPV高危亚型。HPV的DNA可以整合到人基因组上，也可能以游离状态存在。HPV与人基因组的整合主要通过以下作用机制致癌：抑癌基因失活、原癌基因被激活、宿主染色体重排、宿主甲基化模式改变等。

研究方法

本研究从泉州市第一医院入组3例宫颈癌患者，其中一例患者呈HPV16+，另外两位患者呈HPV-，患者的详细临床信息见表1。

取患者的术后肿瘤和癌旁正常组织，抽提总DNA和RNA，分别进行全外显子组测序和转录组测序，并结合患者的临床信息进行数据分析。同时从GDAC官网(http://gdac.broadinstitute.org)下载TCGA中99例宫颈癌患者队列（HPV16+患者93例、HPV-患者6例）的基因组体细胞突变数据和拷贝数变异数据，作为独立验证组，用于验证本研究结论的可重复性。

结果

HPV-患者肿瘤组织存在更多的体细胞突变

三个患者中共发现64个基因发生了体细胞突变，其中HPV16+患者的突变数量明显少于HPV-患者（图1A），且两组患者的突变基因无交集（图1B）。在TCGA的分析结果中也证实了这一现象（图1C），HPV16+和HPV-组的突变基因存在较少的交集。对TCGA中HPV16+组特异性的突变基因进行通路富集分析，突变基因显著富集到了与病毒感染相关的通路role of PKR in interferon induction antiviral response, caveolar-mediated endocytosis signaling和virus entry via endocytic pathways。

图1：宫颈癌的体细胞突变。（A）三例宫颈癌患者体细胞突变的类型和数量分布；（B）三例患者的突变基因韦恩图；（C）TCGA宫颈癌队列中HPV-和HPV16+患者的体细胞突变数量比较；（D）TCGA中HPV-和HPV16+宫颈癌患者突变基因韦恩图；（E）HPV16+宫颈癌患者特异性突变基因的通路富集分析。

拷贝数变异分析

两例HPV-患者的肿瘤组织呈现出较一致的拷贝数变异，比如1q21-31、1q41-44和3q22-29染色体片段的扩增，与HPV16+患者呈现出较大的差异（图2A）。TCGA的分析结果中显示，HPV-和HPV16+患者的CNV热图呈现出整体相似性，仅有局部的差异。本结果与TCGA的分析结果在染色体扩增上呈现出相似性，比如1q21、1q25、3q26和3q28的扩增。

图2：根据染色体位置绘制的CNV热图。（A）本研究三例宫颈癌患者；（B）TCGA研究中的宫颈癌队列。

差异表达基因

宫颈癌组织与癌旁对照组织相比，发现了1755个差异表达基因，其中758个基因上调，997个基因下调（图3A）。基因表达热图显示，两例HPV16-患者呈现出了一致的表达图谱，而HPV16+的基因表达图谱与另外两例患者截然不同。聚类结果显示，HPV-患者的癌和癌旁组织发生了明显的分离，而HPV16+患者的癌旁组织与癌组织聚类到一起（图3B）。

对差异表达基因进行信号通路和功能的富集分析，图3D展示了根据P值排前10位的信号通路包括cell cycle control of chromosomal replication、cell cycle: G2/M DNA dam age checkpoint regulation、molecular mechanisms of cancer等。图3E展示了功能富集的前10位包括cell adhesion、biological adhesion、response to endogenous stimulus等。我们发现GO功能富集条目多与吸附功能相关，吸附功能是影响细胞移动的主要因素，而信号通路主要与细胞周期相关。

图3：宫颈癌的差异表达基因。（A）差异基因筛选火山图；（B）差异表达基因的聚类热图；（C）肿瘤组织中显著上调和显著下调的前10名基因；差异基因的通路富集分析（D）和GO富集分析结果（E）。

CNV与基因表达水平的关联分析

基因的拷贝数是影响基因表达水平的重要因素，本研究对三个患者分别进行基因的拷贝数水平和表达水平线性拟合分析。结果表明，HPV-的两名患者肿瘤组织中基因的拷贝数水平与表达水平呈显著正相关，而HPV16+患者中没有显著相关性。

图4：基因CNVs和表达水平的整合分析，（A、B）HPV-宫颈癌患者；（C）HPV16+宫颈癌患者。

图5A通过韦恩图展示了三个样本中同时发生扩增和表达上调的基因，其中两个HPV-患者之间共享绝大多数的基因（127个基因），而HPV16+患者发生扩增和表达上调的基因很少。图5B展示了同时发生缺失和表达下调的基因，三个患者之间存在广泛的交集。

图5：同时扩增和表达上调基因（A）、和同时缺失和表达下调基因（B）在三例患者中的分布韦恩图。

结论

本研究发现HPV16+的宫颈癌患者和HPV-的宫颈癌患者，肿瘤组织在基因组水平和转录组水平都呈现出了较大的差异。与HPV-患者相比，HPV16+患者的基因组突变（包括SNVs和CNVs）较少。作者认为产生这种结果的原因主要是HPV+宫颈癌的致癌机制明确，如HPV中癌蛋白E6和E7的激活、HPV DNA与人基因组的整合等。而HPV-患者无明确致癌原因，在癌变的过程中会积累大量的“passenger mutations”。另外，对于HPV+患者的癌旁对照组织同样呈HPV阳性，而癌旁组织同样会受HPV影响，发生相应的基因组改变和转录水平改变。本研究以癌旁组织为对照，鉴定基因组变异以及差异表达基因，在此过程中，癌组织和癌旁对照组织共有的变异或表达水平改变会被过滤。

简言之，本研究综合运用全外显子组和全转录组测序技术，鉴定出了与HPV感染相关的宫颈癌基因变异和表达差异基因，为宫颈癌的发病机理研究提供了一些新的见解。

参考文献：

Whole-exomeand RNA sequencing reveals novel insights into the pathogenesis of HPVassociated cervical cancer. Cancer Biomark. 2019 Jun 27. doi:10.3233/CBM-190055.

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